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在New Brunswick S41i CO2恒溫搖床內采用透氣袋實現人類T細胞快速擴增
點擊次數:13482 發布日期:2019-2-11  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

在New Brunswick™ S41i CO2恒溫搖床內采用透氣袋實現人類T細胞快速擴增
Amanda Suttle、 Stacey Willard、 Ma Sha
美國康涅狄格州恩菲爾德艾本德公司   聯系方式: [email protected]
 

摘要

近年來細胞治療領域取得的進步大大提升了對T細胞擴增技術的需求。 T細胞必須能夠迅速擴增, 才能在維持高存活率和T細胞屬性的同時達到高細胞密度。 攪拌罐生 物反應器是實現大規模擴增的最佳細胞培養工具之一。 然而, 在生物反應器內進行細胞培養需接種大量細胞。 我們開發出了利用透氣袋為臺式生物反應器接種生產 足量T細胞的方法。
我們利用放置在New Brunswick S41i CO2恒溫搖床內的透氣袋進行懸浮T細胞培養, 并測試了來自不同制造商的細胞培養袋, 最大灌注量從120 mL到5 L不等。 此外, 我們還測試了不同的振蕩速度, 以確定T細胞擴增的最佳條件。 由于T細胞放置在固定平臺上無法生長, 所以需要適當的振蕩。 我們還探索了更傳統的利用振蕩搖瓶 進行懸浮培養的方法。 結果表明, 使用透氣袋更為成功, 不到4天其擴增量就超過了10倍, 而在搖瓶中則只擴增了2 - 3倍。 綜上所述, 我們利用透氣袋和CO2恒溫搖 床, 建立了一種在攪拌罐生物反應器內大規模制備培養T細胞的方法。

介紹

在過去的幾年里, 許多研究和開發實驗室一直在研究可以實現T細胞大量生長的條件, 以支持細胞治療應用對高質量T細胞需求的增長。 一直以來, 血庫實驗室進行T 細胞培養的主要目標都是維持細胞群以便后續輸注。 該技術尚無法滿足研發和商業使用所需的水平。 利用生物反應器培養法擴增細胞是經過充分論證的, 但還沒有 針對淋巴細胞進行充分地優化。 實際上, T細胞敏感而脆弱, 既往實驗都證明很難為臺式生物反應器接種生產足夠的細胞。
其他的懸浮哺乳動物細胞, 包括諸如干細胞等敏感細胞, 可以如前所示, 利用CO2控制的恒溫搖床成功在搖瓶中培養[1]。 然而, 鑒于我們利用搖瓶法對原代人類T細 胞進行培養的初步研究并未取得成功。 因此, 我們又開發出了在New Brunswick S41i CO2恒溫搖床(艾本德, S41I1200100) 中通過振蕩透氣袋來培養這些T細胞的 新方法。 該方法顯著優化了T細胞培養, 得到了能夠為臺式生物反應器接種生產出足量T細胞的快速有效的初始擴增條件。 例如, 在臺式研究中, 我們采用了一臺 BioBLU® 3c一次性罐(艾本德, 1386000300) ,設置為最大工作容積(3.75 L), 目標細胞接種密度為0.5 x 106 cells/mL, 則生物反應器接種總共需要1.88 x 108個細 胞。 該研究還建立了低溫保存T細胞的方法, 這對此項研究至關重要。 通過建立低溫保存庫, 可將相同批次的細胞用于多個優化實驗。

材料和方法

本研究采用一臺New Brunswick S41i Co2恒溫搖床進行T細胞擴增操作, 所用設備和試劑的完整列表見表1。

表1: 本研究所用設備、 耗材和試劑列表


培養基配方和恒溫搖床設置
本研究的完全培養基配方包括Lonza的X- VIVO 10基礎培養基(不含慶大霉素和酚紅), 還添加了5%熱滅活人血清、 2 mM谷氨酰胺、 2 mM抗菌-抗真菌劑, 以及20 μg/mL IL-2。
在所有研究中, S41i Co2恒溫搖床都設置為5% CO2 水平。 將懸浮方瓶中生長的T細胞培養物放置在靜置架上。 在Evolve袋中生長的T細胞培養物則放置在振蕩平臺 上, 并利用膠帶將袋子各邊粘在平臺上將其固定(圖1)。 固定住袋子后, 將搖床設置為默認的70 rpm振蕩速度(除非另有說明)。 本研究的其余部分也采用該等設定 值和培養基配方。 如圖1所示, S41i Co2恒溫搖床可用于多種不同的T細胞培養方法。

圖1: S41i恒溫搖床能夠同時支持搖瓶、 懸浮T-25方瓶和細胞培養袋進行T細胞培養


優化Evolve透氣袋中的T細胞解凍和初始培養
我們對從STEMCELL Technologies購得的一瓶原代人外周血全T細胞采用了兩 種不同的方法進行了解凍, 兩種方法都使用了ThawSTAR CFT2自動解凍儀對瓶 裝細胞進行解凍操作。 STEMCELL Technologies建議將T細胞解凍至T-25方瓶, 并靜置兩天。 使用5 mL最大灌注量的新鮮完全培養基。 T細胞培養的頭兩天遵循 該方案, 然后將細胞轉移至Evolve袋中繼續培養。 為了確定實現最佳細胞生長和 存活率是否有必要采取靜置培養步驟, 我們評估了另一種方法, 即直接將瓶裝細 胞解凍至120 mL的Evolve細胞培養袋中。 在研究的這部分中采用的是80 mL工作 容積的Evolve袋。 使用Vi-CELL Xr細胞存活率分析儀每天對兩種方案進行取樣和 計算, 以監測細胞的生長和存活率。此外, 還使用了Life Technologies的EVOS FL 細胞成像系統檢查120 mL Evolve袋內的培養物。 圖2顯示的是以10X放大倍數拍 攝的人類外周血全T細胞。

圖2: 使用Life Technologies的EVOS FL細胞成像系統在10X放大倍數下拍攝的Evolve 120 mL細胞培養袋內的T細胞生長情況

 

創建低溫保存T細胞庫和冷凍培養基配方
創建細胞庫對本研究而言非常重要, 因為在進行廣泛研究時, 購買多瓶原代人類 T細胞會使得成本過高。 一旦發現T細胞擴增的最佳條件, 便選擇一包密度最高、 生存能力最強的Evolve袋復凍回細胞庫中。 低溫保存的培養基配方如表2所示。 首先,向已用培養基的細胞內再添加5%的熱滅活人血清,將血清總濃度提升至 10%。然后,向該混合液內注入新鮮培養基。不得使用離心機對細胞進行標準回 凍等離心操作, 而是將DMSO直接添加到細胞和培養基的混合物中。 然后, 將其 分配到1 mL的低溫保存管中。 隨后, 將低溫保存管放入BioCision CoolCell, 置 于溫度設置為-80 ˚C的New Brunswick Innova U360 ULT冰箱內過夜。 24小時后, 將其移入液態氮中進行長期保存。


優化Evolve透氣袋的培養條件
解凍法得到優化后, 則針對理想的細胞生長和擴增能力對Evolve袋進行進一步評 估。 T細胞直接解凍至最大灌注量為120 mL的Evolve袋中, 工作容積為30 mL, 密度為0.5 x 106 cells/mL。 通過加入新鮮的完全培養基維持該密度水平, 直到工 作容積達到100 mL。 當袋子達到100 mL工作容積后, 根據需要, 可通過取出50 mL培養基, 替換成新鮮的完全培養基, 實現50%的容積置換, 以維持0.5 x 106 cells/mL的密度水平。

比較搖瓶和透氣袋中的T細胞培養
此外, 本研究還使用了New Brunswick S41i Co2恒溫搖床對不同振蕩速度下帶擋 板和不帶擋板的一次性搖瓶培養和透氣袋培養方案進行了比較。 每個搖瓶的接種 密度都為0.5 x 106 cells/mL, 利用了250 mL搖瓶20%的工作容積。 作為對照, 也采用上述標準最佳設定值和接種密度將T細胞放置在工作容積為100 mL的120 mL Evolve細胞培養袋中進行生長。

使用不同的透氣袋評估擴大規模的可能性
當優化了120 mL Evolve袋T細胞培養后, 便開始嘗試擴大規模, 首先從500 mL Evolve袋開始。 情況與上述情況一致。
我們還對另一制造商相似容積的透氣袋的培養效果進行了研究。 除了大尺寸Evolve袋, 我們還使用了Lampire Biological Laboratories OMNI C3 250 mL細胞培養袋。 雖然Evolve袋的最大灌注量為500 mL, 我們只使用了200 mL工作容積, 以便將其與最大工作容積相對較小的Lampire袋進行比較。

結果與討論

優化T細胞解凍方法和初始培養
我們對T細胞采取了兩種解凍方法, 一種遵守了制造商建議的靜置培養保持時間, 另一種則沒有(見材料和方法)。 每天對兩種培養基進行取樣并監測細胞生長和存 活率。 過了初始解凍期后, 將其放入細胞培養袋中進一步培養, 細胞密度維持在0.5×106cells/mL水平, 并加入新鮮培養基以達到100 mL最大工作容積。 繼續采用直 接解凍至袋中的方法。 相比懸浮方瓶靜置解凍法, 該方法不僅更為方便, 峰值細胞密度也超過了前者。數據如圖3所示。

圖3: 靜置解凍法與直接解凍至袋內比較(解凍后, 都采用為期8天的袋內培養)


建立T細胞低溫保存庫
許多制造商不保證低溫保存后細胞能夠存活。 然而, 我們已經通過自己的處理技術和培養基配方證明了可以將細胞保存起來, 以備將來使用(圖4)。

圖4: 將T細胞從低溫保存細胞庫取出解凍后, 在透氣袋內培養生長, 并進行為期5天的監測


比較搖瓶和透氣袋中的T細胞培養
搖瓶內培養的細胞生長密度并未達到同期透氣袋培養的細胞密度水平。 如圖5所示。 由于搖瓶和細胞培養袋的工作容積不同, 圖5顯示的是50 mL灌注量獲得的細胞總 數, 以便進行比較。 在95和100 rpm的搖瓶培養中也觀察到大量的細胞團。 在70 rpm搖瓶和透氣袋培養中未觀察到細胞團。 鑒于搖瓶培養表現不佳, 我們放棄了搖瓶 法, 將重點放在透氣袋培養上, 并利用更大尺寸的透氣袋進一步探索擴大規模的可能。

使用不同的透氣袋評估擴大規模的可能性
為了確定Evolve袋是否是擴大生物反應器接種T細胞規模的理想方法, 本研究測試了另一制造商的細胞培養袋。 每天對每個袋子進行取樣, 連續7天。 結果如圖6所示, 200 mL工作容積的Lampire袋的密度大于較大尺寸的Evolve袋。 雖然峰值密度低于120 mL的Evolve袋, 但Lampire袋的總細胞數量比較大尺寸的Evolve袋高出了2.5 倍 (未顯示數據)。 我們還測試了1 L到5 L的更大尺寸的透氣袋, 但在最初的評估中未能成功實現T細胞擴增。

圖5: 在塑料搖瓶中以不同振蕩速度培養的T細胞相比透氣袋培養的效果


圖6: 比較較大尺寸的Evolve透氣袋和Lampire透氣袋在人類T細胞擴增方面的表現

 

結論

通過本研究, 成功地建立了細胞庫以便進行進一步的實驗。 在Evolve透氣袋中, T細胞擴增明顯。 采用120 mL Evolve透氣袋時, New Brunswick S41i CO2恒溫搖床 的振蕩平臺共可容納10包Evolve袋。 如果10個Evolve袋的灌注量都為100 mL, 且密度均達到3.91 x 108個細胞/袋(圖3), 則1 L液體就可以達到3.91 x 109個T細胞存 活總量。在該密度條件下, BioBLU 3c一次性罐在3.75 L最大工作容積時,可接種大約255 mL的細胞數量。 利用S41i恒溫搖床擴增的單批T細胞, 可實現1 L細胞接種 4臺達到最大工作容積(3.75 L) 的BioBLU 3c一次性罐。
對Lampire透氣袋的初步研究也顯示了可以擴大規模的潛力。 Lampire袋的最大工作容積為250 mL。 本研究中, 其工作容積為200 mL。 S41i Co2恒溫搖床2恒溫搖床 的振蕩平臺最多可容納6包Lampire袋, 可以將細胞總容量擴大至1.2 L。
本研究表明, 透氣袋搭配S41i Co2恒溫搖床可實現T細胞的快速初始擴增, 其能夠產生足量的細胞接種多個臺式生物反應器。

參考文獻

[1] Khandaker Siddiquee和Ma Sha。 Microcarrier-Based Expansion of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells in Shake Flasks.Bioprocessing Journal, Volume 12, Issue 4, Winter 2013.

來源:艾本德中國有限公司
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